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IWA微信公眾號(hào)此前曾在多篇推送中介紹過(guò)有關(guān)對(duì)污水中新冠病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)的研究和實(shí)踐。荷蘭是最早在污水中發(fā)現(xiàn)新冠病毒RNA片段的國(guó)家之一。荷蘭KWR水循環(huán)研究所正是背后的推動(dòng)力。他們有一支研究團(tuán)隊(duì)早在2017年就開(kāi)始研究基于第二代測(cè)序技術(shù)(NGS)在水管理的應(yīng)用潛力。經(jīng)過(guò)這幾年的科研積累，荷蘭率先在污水中檢測(cè)新冠病毒也是合情合理的事。
第二代DNA測(cè)序技術(shù)又稱(chēng)下一代測(cè)序技術(shù)(Next-Generation Sequencing, 簡(jiǎn)稱(chēng)NGS)。所謂第二代，是相對(duì)較早出現(xiàn)的Sanger雙脫氧核苷酸測(cè)序技術(shù)（簡(jiǎn)稱(chēng)Sanger測(cè)序）而言的。其實(shí)NGS技術(shù)早在2005年前后就面世了，憑借其超高通量、可擴(kuò)展性和速度等特點(diǎn)，如今已成為生物與醫(yī)學(xué)研究的常見(jiàn)通用工具。
圖. NGS測(cè)序技術(shù)的流程原理圖 | 圖源：Pinterest
近幾年，NGS技術(shù)在污水處理領(lǐng)域的應(yīng)用也愈發(fā)普及。借助NGS技術(shù)，我們可以對(duì)單細(xì)胞和單細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序，也可以分析水中的DNA信息，了解到污水中的微生物組成。這為水務(wù)部門(mén)提供了新的監(jiān)測(cè)和管理工具。雖然我們印象中的荷蘭有著一流的水務(wù)管理經(jīng)驗(yàn)，但在他們自己的水務(wù)部門(mén)看來(lái)，荷蘭的地表水的水質(zhì)目前也遭受到壓力，其中包括了污水管網(wǎng)的溢流以及污水廠(chǎng)出水排放的影響，因?yàn)槲鬯锌赡軙?huì)含有糞便或者其他有害微生物。
地表水、污水廠(chǎng)的進(jìn)水和出水、地下水都有它們各自的微生物組成，或者稱(chēng)獨(dú)一無(wú)二的微生物指紋。基于NGS技術(shù)得到的DNA指紋圖譜是否適用于識(shí)別微生物污染物并檢測(cè)出污染源的位置呢？
從管理者的角度而言，精準(zhǔn)找出污染源頭是解決任何污染問(wèn)題的關(guān)鍵一步。所以荷蘭的水務(wù)管理者，包括地方政府和水委會(huì)，對(duì)以下四個(gè)問(wèn)題非常感興趣。
是否可以污水監(jiān)測(cè)溢流對(duì)地表水的影響？是否可隊(duì)特定溢流進(jìn)行追溯？
污水處理廠(chǎng)的污水排放是否可追溯？如果可以的話(huà)，最遠(yuǎn)追溯距離是多少？
污水廠(chǎng)出水或者曝氣池的污水泄漏到地下水的話(huà)，可追溯的最遠(yuǎn)距離是多少？
是否可以追溯某一地表水源流入其它地表水源（例如洪水蓄水池）的方向？
基于以上問(wèn)題，荷蘭的KWR水循環(huán)研究所聯(lián)合多個(gè)地方水委會(huì)，開(kāi)展了相關(guān)研究。該項(xiàng)目得到了荷蘭經(jīng)濟(jì)部和荷蘭的知識(shí)和創(chuàng)新頂級(jí)聯(lián)盟（TKI）的聯(lián)合資助。在本期的微信推送里，我們將帶大家了解他們的研究結(jié)果。
研究方法及設(shè)計(jì)
通俗點(diǎn)說(shuō)，無(wú)論是用第一代還是第二代的測(cè)序技術(shù)，都能得到一個(gè)細(xì)菌或者一個(gè)種群的指紋圖譜，只是新一代的技術(shù)靈敏度更高，測(cè)得更準(zhǔn)確、樣本量更少、完整度更好。總的來(lái)說(shuō)，就是NGS技術(shù)更簡(jiǎn)單卻更便宜，自然吸引更多科學(xué)家應(yīng)用到其具體細(xì)分領(lǐng)域里。
在本研究中，研究團(tuán)隊(duì)從荷蘭五個(gè)污水處理廠(chǎng)32個(gè)點(diǎn)進(jìn)行采樣，涵蓋了其進(jìn)水、出水以及地表水的樣品。針對(duì)第三個(gè)問(wèn)題，他們還從污水廠(chǎng)的曝氣池和四個(gè)地下水監(jiān)測(cè)井中取樣。采樣時(shí)間分為2017年6-11月和2018年3-9月兩個(gè)階段。
分析工作分為三步，首先是用NGS測(cè)序技術(shù)來(lái)測(cè)定特定DNA序列，然后再用生物信息學(xué)軟件來(lái)建立相關(guān)微生物的DNA指紋，最后用源頭跟蹤工具來(lái)判斷微生物指紋圖譜的來(lái)源類(lèi)型。
測(cè)定微生物DNA指紋
每個(gè)采樣點(diǎn)都取其平均值作為結(jié)果。下圖1顯示了最常見(jiàn)的25種細(xì)菌在進(jìn)水和出水的平均豐度。進(jìn)水有著非常典型的微生物群落，它們主要源自人和動(dòng)物腸道的糞便微生物和在污水中滋生的細(xì)菌，包括桿狀桿菌(Arcobacter)，不動(dòng)桿菌(Acinetobacter)，氣單胞菌(Aeromonas)和滴蟲(chóng)(Trichococcus)。其中出水的特征微生物群中Saccharimonadales、Neisseriaceae和Fodinicola等細(xì)菌。和進(jìn)水的情況不同的是，每個(gè)污水處理廠(chǎng)出水的DNA指紋特征差異更大。
圖. 污水處理廠(chǎng)進(jìn)出水的“微生物指紋圖”。在兩類(lèi)樣品中都能找到25種最常見(jiàn)的微生物屬。各種微生物的出現(xiàn)程度用多個(gè)采樣點(diǎn)的相對(duì)豐度平均值表示。
對(duì)四個(gè)問(wèn)題的回答
問(wèn)題1: 污水溢流的追蹤
分析結(jié)果顯示，污水溢流的微生物指紋圖譜很有辨識(shí)度，因此可以確定特定地表水水體受溢流影響的程度。他們還和威斯康星大學(xué)密爾沃基分校的McLellan教授等人一篇綜述進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)不僅荷蘭下水道的污水的圖譜很穩(wěn)定，美國(guó)、澳大利亞、巴西、甚至中國(guó)等地的污水管網(wǎng)的情況也類(lèi)似。因此他們通過(guò)這些指示細(xì)菌對(duì)污水進(jìn)行跟蹤是可行的。
但由于這類(lèi)污水在不同地方和采樣點(diǎn)的圖譜如此接近，以致在有多個(gè)地方發(fā)生溢流的時(shí)候，無(wú)法精確找出溢流的位置。他們認(rèn)為一個(gè)解決方案是在靠近溢流點(diǎn)的位置進(jìn)行采樣，還可能繼而算出溢流頻率。
問(wèn)題2: 污水廠(chǎng)出水的追蹤
污水廠(chǎng)的出水能追蹤到多遠(yuǎn)？針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，他們對(duì)污水廠(chǎng)出水排入的徑流和該徑流匯入的另一條徑流設(shè)置了5個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)。下圖是采樣結(jié)果。他們?cè)趶搅?的污水廠(chǎng)出水排放點(diǎn)的上游和下游分別設(shè)置了一個(gè)采樣點(diǎn)。他們使用的一個(gè)溯源工具(Source Tracker Tool)分析顯示，上游離排放點(diǎn)750米的采樣點(diǎn)1和排放點(diǎn)圖譜接近度有41%。他們無(wú)法確定是受到下游污水廠(chǎng)排放點(diǎn)影響還是該點(diǎn)的上游還有其他污水廠(chǎng)。而下游離2000米的采樣點(diǎn)圖譜和排放點(diǎn)圖譜有接近度達(dá)70%。他們還指出，采樣時(shí)間和季節(jié)的變化會(huì)顯著影響微生物的組成。
采樣點(diǎn)4是徑流1和徑流2交匯點(diǎn)的上游，采樣點(diǎn)5則是交匯點(diǎn)的下游2000米的位置。盡管有55%的相似度，但實(shí)際上我們可以認(rèn)為點(diǎn)4是不受污水廠(chǎng)排放點(diǎn)影響的。采樣點(diǎn)5的結(jié)果則說(shuō)明了在距離污水廠(chǎng)4公里外的徑流依然會(huì)受到污水廠(chǎng)排放的影響。
通過(guò)上述結(jié)果，雖然我們看到微生物指紋圖譜可以反映污水廠(chǎng)出水確實(shí)對(duì)地表水水質(zhì)造成影響。但由于上游水質(zhì)受其他不確定因素干擾，貌似目前的技術(shù)似乎還很難反推某座污水廠(chǎng)對(duì)下游水質(zhì)的影響程度。
圖. 5個(gè)測(cè)量點(diǎn)的微生物指紋圖譜。污水廠(chǎng)的出水排入徑流1，徑流1匯入徑流2。通過(guò)溯源工具制作這5個(gè)點(diǎn)的特征菌屬的組成情況。
問(wèn)題3: 可以追蹤污水泄漏地下水的情況嗎?
NGS技術(shù)能不能測(cè)定某座污水廠(chǎng)的污水泄漏影響地下水的情況? 分析結(jié)果顯示，在地下水里(監(jiān)測(cè)井)能發(fā)現(xiàn)污水廠(chǎng)進(jìn)水、出水和曝氣池的微生物圖譜。他們認(rèn)為這表示污水廠(chǎng)存在泄漏或滲漏情況。值得注意的是，此前的氨氮和COD分析結(jié)果顯示不存在泄漏問(wèn)題。基于這點(diǎn)反差，作者認(rèn)為會(huì)有更多管理者有興趣用微生物指紋法來(lái)檢查滲漏情況。
問(wèn)題4: 能否追蹤混合地表水?
雖然分析結(jié)果顯示水系統(tǒng)的DNA指紋圖譜有各自的特征，但它們會(huì)受時(shí)間變化。目前這個(gè)問(wèn)題尚無(wú)確切答案。作者認(rèn)為需要對(duì)不同季節(jié)的水進(jìn)行采樣，來(lái)了解時(shí)間對(duì)水質(zhì)和微生物構(gòu)成的影響，從而得到更加準(zhǔn)確的指紋圖譜。
展望
這個(gè)項(xiàng)目初步顯示了利用微生物指紋圖譜進(jìn)行水污染溯源的可行性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其可行性，作者認(rèn)為下一步需要和傳統(tǒng)的微生物水質(zhì)監(jiān)測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比，例如大腸桿菌和腸球菌菌落計(jì)數(shù)等。另一方面，他們認(rèn)為需要考察數(shù)據(jù)的可定量程度，然后結(jié)合傳統(tǒng)的運(yùn)行參數(shù)進(jìn)行比對(duì)，包括流量、氮磷負(fù)荷等，確認(rèn)NGS技術(shù)和現(xiàn)有參數(shù)的關(guān)聯(lián)程度。更深入的問(wèn)題可能是：污水廠(chǎng)出水排入地表水體后，其微生物種群如何演變？一個(gè)具有健康生態(tài)的水體的微生物最優(yōu)組成應(yīng)該是怎么的？
KWR希望繼續(xù)探索NGS作為水質(zhì)監(jiān)測(cè)工具的潛力，以便更好地定義它的功能界限，讓其為污水處理廠(chǎng)管理水平的提升做出貢獻(xiàn)。
參考資料
https://www.h2o-watermatters.com/#
https://www.kwrwater.nl/wp-content/uploads/2017/07/Poster-TKI-fingerprint.pdf
https://www.circonomist.com/general/dna-fingerprinting-powerful-monitoring-tool-in-water-management/
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166918302076
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22419485/