第二代測序技術（DNA指紋分析）-- 追蹤污染源的新利器
第二代DNA測序技術又稱下一代測序技術(Next-Generation Sequencing, 簡稱NGS)。所謂第二代，是相對較早出現的Sanger雙脫氧核苷酸測序技術（簡稱Sanger測序）而言的。其實NGS技術早在2005年前后就面世了，憑借其超高通量、可擴展性和速度等特點，如今已成為生物與醫學研究的常見通用工具。
圖. NGS測序技術的流程原理圖 | 圖源：Pinterest
近幾年，NGS技術在污水處理領域的應用也愈發普及。借助NGS技術，我們可以對單細胞和單細菌進行測序，也可以分析水中的DNA信息，了解到污水中的微生物組成。這為水務部門提供了新的監測和管理工具。雖然我們印象中的荷蘭有著一流的水務管理經驗，但在他們自己的水務部門看來，荷蘭的地表水的水質目前也遭受到壓力，其中包括了污水管網的溢流以及污水廠出水排放的影響，因為污水中可能會含有糞便或者其他有害微生物。地表水、污水廠的進水和出水、地下水都有它們各自的微生物組成，或者稱獨一無二的微生物指紋。基于NGS技術得到的DNA指紋圖譜是否適用于識別微生物污染物并檢測出污染源的位置呢？
從管理者的角度而言，精準找出污染源頭是解決任何污染問題的關鍵一步。所以荷蘭的水務管理者，包括地方政府和水委會，對以下四個問題非常感興趣。
是否可以污水監測溢流對地表水的影響？是否可隊特定溢流進行追溯？
污水處理廠的污水排放是否可追溯？如果可以的話，最遠追溯距離是多少？
污水廠出水或者曝氣池的污水泄漏到地下水的話，可追溯的最遠距離是多少？
是否可以追溯某一地表水源流入其它地表水源（例如洪水蓄水池）的方向？
基于以上問題，荷蘭的KWR水循環研究所聯合多個地方水委會，開展了相關研究。該項目得到了荷蘭經濟部和荷蘭的知識和創新頂級聯盟（TKI）的聯合資助。在本期的微信推送里，我們將帶大家了解他們的研究結果。
研究方法及設計
通俗點說，無論是用第一代還是第二代的測序技術，都能得到一個細菌或者一個種群的指紋圖譜，只是新一代的技術靈敏度更高，測得更準確、樣本量更少、完整度更好。總的來說，就是NGS技術更簡單卻更便宜，自然吸引更多科學家應用到其具體細分領域里。在本研究中，研究團隊從荷蘭五個污水處理廠32個點進行采樣，涵蓋了其進水、出水以及地表水的樣品。針對第三個問題，他們還從污水廠的曝氣池和四個地下水監測井中取樣。采樣時間分為2017年6-11月和2018年3-9月兩個階段。
分析工作分為三步，首先是用NGS測序技術來測定特定DNA序列，然后再用生物信息學軟件來建立相關微生物的DNA指紋，最后用源頭跟蹤工具來判斷微生物指紋圖譜的來源類型。
測定微生物DNA指紋
每個采樣點都取其平均值作為結果。下圖1顯示了最常見的25種細菌在進水和出水的平均豐度。進水有著非常典型的微生物群落，它們主要源自人和動物腸道的糞便微生物和在污水中滋生的細菌，包括桿狀桿菌(Arcobacter)，不動桿菌(Acinetobacter)，氣單胞菌(Aeromonas)和滴蟲(Trichococcus)。其中出水的特征微生物群中Saccharimonadales、Neisseriaceae和Fodinicola等細菌。和進水的情況不同的是，每個污水處理廠出水的DNA指紋特征差異更大。
圖. 污水處理廠進出水的“微生物指紋圖”。在兩類樣品中都能找到25種最常見的微生物屬。各種微生物的出現程度用多個采樣點的相對豐度平均值表示。
對四個問題的回答問題1: 污水溢流的追蹤
分析結果顯示，污水溢流的微生物指紋圖譜很有辨識度，因此可以確定特定地表水水體受溢流影響的程度。他們還和威斯康星大學密爾沃基分校的McLellan教授等人一篇綜述進行對比，發現不僅荷蘭下水道的污水的圖譜很穩定，美國、澳大利亞、巴西、甚至中國等地的污水管網的情況也類似。因此他們通過這些指示細菌對污水進行跟蹤是可行的。
但由于這類污水在不同地方和采樣點的圖譜如此接近，以致在有多個地方發生溢流的時候，無法精確找出溢流的位置。他們認為一個解決方案是在靠近溢流點的位置進行采樣，還可能繼而算出溢流頻率。
問題2: 污水廠出水的追蹤
污水廠的出水能追蹤到多遠？針對這個問題，他們對污水廠出水排入的徑流和該徑流匯入的另一條徑流設置了5個監測點。下圖是采樣結果。他們在徑流1的污水廠出水排放點的上游和下游分別設置了一個采樣點。他們使用的一個溯源工具(Source Tracker Tool)分析顯示，上游離排放點750米的采樣點1和排放點圖譜接近度有41%。他們無法確定是受到下游污水廠排放點影響還是該點的上游還有其他污水廠。而下游離2000米的采樣點圖譜和排放點圖譜有接近度達70%。他們還指出，采樣時間和季節的變化會顯著影響微生物的組成。
采樣點4是徑流1和徑流2交匯點的上游，采樣點5則是交匯點的下游2000米的位置。盡管有55%的相似度，但實際上我們可以認為點4是不受污水廠排放點影響的。采樣點5的結果則說明了在距離污水廠4公里外的徑流依然會受到污水廠排放的影響。
通過上述結果，雖然我們看到微生物指紋圖譜可以反映污水廠出水確實對地表水水質造成影響。但由于上游水質受其他不確定因素干擾，貌似目前的技術似乎還很難反推某座污水廠對下游水質的影響程度。
圖. 5個測量點的微生物指紋圖譜。污水廠的出水排入徑流1，徑流1匯入徑流2。通過溯源工具制作這5個點的特征菌屬的組成情況。
問題3: 可以追蹤污水泄漏地下水的情況嗎?NGS技術能不能測定某座污水廠的污水泄漏影響地下水的情況? 分析結果顯示，在地下水里(監測井)能發現污水廠進水、出水和曝氣池的微生物圖譜。他們認為這表示污水廠存在泄漏或滲漏情況。值得注意的是，此前的氨氮和COD分析結果顯示不存在泄漏問題。基于這點反差，作者認為會有更多管理者有興趣用微生物指紋法來檢查滲漏情況。
問題4: 能否追蹤混合地表水?
雖然分析結果顯示水系統的DNA指紋圖譜有各自的特征，但它們會受時間變化。目前這個問題尚無確切答案。作者認為需要對不同季節的水進行采樣，來了解時間對水質和微生物構成的影響，從而得到更加準確的指紋圖譜。
展望
這個項目初步顯示了利用微生物指紋圖譜進行水污染溯源的可行性。為了進一步驗證其可行性，作者認為下一步需要和傳統的微生物水質監測方法進行對比，例如大腸桿菌和腸球菌菌落計數等。另一方面，他們認為需要考察數據的可定量程度，然后結合傳統的運行參數進行比對，包括流量、氮磷負荷等，確認NGS技術和現有參數的關聯程度。更深入的問題可能是：污水廠出水排入地表水體后，其微生物種群如何演變？一個具有健康生態的水體的微生物最優組成應該是怎么的？
KWR希望繼續探索NGS作為水質監測工具的潛力，以便更好地定義它的功能界限，讓其為污水處理廠管理水平的提升做出貢獻。
參考資料
https://www.h2o-watermatters.com/#
https://www.kwrwater.nl/wp-content/uploads/2017/07/Poster-TKI-fingerprint.pdf
https://www.circonomist.com/general/dna-fingerprinting-powerful-monitoring-tool-in-water-management/
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166918302076
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22419485/