36種檢測污水中的新冠病毒方法：美國的系統(tǒng)對(duì)比分析
圖. 研究項(xiàng)目截圖 | 圖源：waterrf.org
這個(gè)項(xiàng)目的立項(xiàng)題目為Interlaboratory and Methods Assessment of the SARS-CoV-2 Genetic Signal in Wastewater。顧名思義，就是對(duì)不同實(shí)驗(yàn)室檢測污水廠進(jìn)水中的新冠病毒方法的可靠性進(jìn)行比較評(píng)估。項(xiàng)目主要考察了四個(gè)方面的問題：
哪種實(shí)驗(yàn)室方法最適合為SARS-CoV-2產(chǎn)生可靠的定量遺傳信號(hào)？
實(shí)驗(yàn)室遵照質(zhì)控操作重現(xiàn)樣品結(jié)果的程度？
給定方法中，哪些步驟對(duì)準(zhǔn)確性和精準(zhǔn)性最為關(guān)鍵？
廢水中SARS-CoV-2遺傳信號(hào)的檢測限及不同方法間的差異？
美國WRF委派了TRUSSELL TECHNOLOGIES公司來開展具體工作，他們?cè)?個(gè)多月的時(shí)間里就得到了初步結(jié)果，并通過網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)和業(yè)界分享了他們的研究成果，隨后還將結(jié)果整理發(fā)表在在英國皇家化學(xué)學(xué)會(huì)(RSC)旗下期刊Environmental Science: Water Research & Technology上。
在2020年6月前，Trussell公司向全美60多個(gè)實(shí)驗(yàn)室發(fā)出參與邀請(qǐng)。經(jīng)過篩選，他們最后選出了19個(gè)州的32個(gè)符合要求的實(shí)驗(yàn)室參與到這個(gè)項(xiàng)目中。因?yàn)槠渲杏兴膫€(gè)實(shí)驗(yàn)室對(duì)兩種不同的方法進(jìn)行了測試，所以這個(gè)項(xiàng)目一共考察了36種檢測方法。
項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)根據(jù)分析方法中的兩大差異，將這36種方法分為了八大類。這兩大差異是指：第一點(diǎn)在于是否去除樣品中的固體，第二點(diǎn)是濃縮方法的差別，其中一共有四種情況，一種是不進(jìn)行濃縮，另外三種分別采用超濾、過濾和聚乙二醇(PEG)等濃縮方法。
圖. 分析方法的分類 | 圖源：WRF
盡管每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都有自己的SOP(標(biāo)準(zhǔn)操作程序)，但項(xiàng)目組會(huì)要求每個(gè)實(shí)驗(yàn)室都必須遵守由Trussell Technologies公司制定的一份長達(dá)202頁的質(zhì)量保證項(xiàng)目計(jì)劃（QAPP-Quality Assurance Project Plan）。該文件寫清了質(zhì)量保證/質(zhì)量控制（QA/QC）要求。這份QAPP的目的在于確保分析全流程的一致性，包括樣品收集、運(yùn)輸、處理、分析方法的質(zhì)量控制和數(shù)據(jù)管理等。QAPP的關(guān)鍵要素包括添加盲樣、陽陰性對(duì)照，抑制對(duì)照、空白方法等。
圖. 分析流程簡介 | 圖源：wrf
基質(zhì)添加是實(shí)驗(yàn)的重要因素。對(duì)此，他們考察了兩種標(biāo)準(zhǔn)樣。雖然有一種基質(zhì)的回收率高達(dá)100%，但因?yàn)榱硪环N基質(zhì)的回收率與SARS-Cov-2更接近（25%），所以項(xiàng)目組采用了這種基質(zhì)，即人類冠狀病毒OC43(betacoronavirus 1 (ATCC® VR-1558?))
圖. 兩個(gè)采樣點(diǎn)的位置 | 圖源：RSC
圖. 在加州污水廠的采樣現(xiàn)場 | 圖源 ：WRF
每個(gè)實(shí)驗(yàn)室會(huì)處理10個(gè)樣品，一般是5個(gè)來自污水廠A，5個(gè)來自污水廠B。但有8個(gè)實(shí)驗(yàn)室考察熱巴氏殺菌的影響(60分鐘的60°C)，這8個(gè)實(shí)驗(yàn)室則都分析10個(gè)來自同一個(gè)污水處理廠的樣品，其中5個(gè)有加熱，另外5個(gè)沒有。
項(xiàng)目最后得到超過2000個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。他們主要得到以下結(jié)論：
這些不同實(shí)驗(yàn)室方法的比較顯示了污水中的新冠病毒遺傳信號(hào)的定量檢測高度的重現(xiàn)性。在8組方法中，80％的結(jié)果差值在每升+/- 1log的基因組拷貝數(shù)之間（GC/L）。
數(shù)據(jù)顯示濃縮方法的不同和是否去除固體對(duì)結(jié)果沒有系統(tǒng)性影響。其他方法之間的差異，例如巴氏殺菌、引物組的選擇和PCR平臺(tái)的選擇，造成的差異也不大。
嚴(yán)格的QA/QC要求、標(biāo)準(zhǔn)化的計(jì)劃促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果重現(xiàn)性
多種方法都能得到高的靈敏度和檢測限。
圖. 不同方法的結(jié)果都在±1 log GC/L之間，體現(xiàn)良好的重現(xiàn)性 | 圖源：RSC
基于這些結(jié)果，項(xiàng)目組認(rèn)為對(duì)同一個(gè)地區(qū)來說，最重要的是堅(jiān)持使用同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室或者相同的SOP，這樣才能確保結(jié)果的可靠性。這也意味著檢測污水可以跟蹤新冠病毒的傳播趨勢。美國水研究基金會(huì)的首席執(zhí)行官Peter Grevatt博士說：“我們很高興與水業(yè)同行及時(shí)分享這項(xiàng)重要的研究成果。”他表示，這個(gè)調(diào)查項(xiàng)目的結(jié)果給各地區(qū)實(shí)驗(yàn)室提供了繼急需的信息，幫助他們了解進(jìn)行污水管網(wǎng)和污水廠的監(jiān)控研究時(shí)需要的方法指南。
下一步計(jì)劃
考慮到各地在方法選擇上會(huì)受到當(dāng)?shù)貙?shí)際情況的約束，所以目前實(shí)現(xiàn)全美的方法統(tǒng)一不現(xiàn)實(shí)。但項(xiàng)目也指出 ，各地的實(shí)驗(yàn)室依然有空間找到適合自身情況的“最佳”方法。其中的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)包括靈敏度、成本、操作員的經(jīng)驗(yàn)水平、材料要求、通量(處理時(shí)間)等。這個(gè)項(xiàng)目會(huì)持續(xù)到今年年底，項(xiàng)目組會(huì)繼續(xù)填補(bǔ)污水流行病學(xué)的知識(shí)空白，另外會(huì)繼續(xù)鼓勵(lì)不同方法和實(shí)驗(yàn)室之間的協(xié)作。
感興趣的讀者，可以通過以下網(wǎng)址下載該項(xiàng)目的質(zhì)量保證計(jì)劃（QAPP）：
https://www.waterrf.org/research/projects/interlaboratory-and-methods-assessment-sars-cov-2-genetic-signal-wastewater
這份文件非常詳細(xì)介紹了用于規(guī)劃、實(shí)施和評(píng)估質(zhì)量保證和質(zhì)量控制程序的政策和方法。如果您從事這方面的工作，應(yīng)該非常值得一讀。
IWA曾于今年4月份組織了關(guān)于 “污水種新冠病毒檢測”（Detecting COVID-19 Variants in Wastewater）的網(wǎng)絡(luò)研討會(huì)，大家可訪問IWA官網(wǎng)查看相關(guān)消息。
參考資料
https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.est.0c06191
https://www.nbcnews.com/think/opinion/covid-virus-spread-can-be-combatted-through-environmental-testing-why-ncna1256660
https://cwn-rce.ca/wp-content/uploads/Dec-1-2020-COVID-19-Wastewater-Coalition-Webinar-Phase-1-Inter-Laboratory-Study-Outcomes.pdf
https://www.waterrf.org/research/projects/interlaboratory-and-methods-assessment-sars-cov-2-genetic-signal-wastewater